高压灭菌塑封器械有效期,医疗器械的清洗消毒与灭菌分析详解 -爱游戏平台

医疗器械是指医学领域内所使用的各种器械，包括用于临床诊断治疗的各种器械、医学试验和临床检验的各种器材。

使用后的器械污染严重，许多器械带有血迹、脓迹、干燥的排泄物和分泌物，若清洗不彻底会给灭菌带来困难甚至造成灭菌失败。国内有调查证明，一些已经灭菌处理的器械上仍存在一些潜血阳性，特别是带有齿、缝隙、细孔和关节的器械比较难清洗，容易造成清洗不彻底现象。医疗器械上污染的蛋白性有机物清洗不彻底，对微生物具有保护作用，容易造成灭菌失败。造成器械清洗不彻底的原因主要是对清洗不够重视、刷洗不够仔细，难洗的部位被忽略和遗漏，所用洗涤剂或清洗方法不当等。

根据现代预防医学观点，污染医疗器械的处理程序应该是消毒、清洗、干燥、灭菌，这样更有利于减少医护人员医院内职业感染，保护环境不受污染，更符合卫生学要求。为了便于科学合理处理污染医疗器械，应该对现代医疗器械消毒灭菌技术及其应用与进展，医疗器械形状结构、材料分类等对消毒灭菌处理的特别要求有比较好的了解。

医疗器械分类

对医疗器械进行分类是为正确进行清洗，科学合理地选用消毒灭菌方法，确保消毒灭菌效果。

（一）按危险程度分类 1.高度危险物品即关键性物品（1）是指那些在临床医疗中要穿入皮肤和黏膜或接触人体无菌组织和体液或接触新生儿和免疫功能极度低下者的物品。（2）主要包括各种外科器械，穿刺器械（注射器、穿刺针、针灸针等），输血输液器具，无菌内窥镜（腹腔镜、关节镜、羊水镜及其它窥镜的活检钳），各种体内导管（心导管、静脉导管、各种造影导管、内脏引流管），体内植入物（人工器官、植入药物等），心肺氧合机，手术隔离衣帽，无菌巾单，外科手套，icu病房用品和新生儿用品等。（3）高度危险物品必须进行灭菌处理。

2.中度危险物品即半关键物品（1）是指那些只接触人体完整的皮肤黏膜的物品。（2）主要包括普通内窥镜（胃镜、肠镜、气管镜、尿道镜及其它接触体腔的内镜），呼吸麻醉装置，膜透析器，婴儿隔离服，婴儿孵育箱，口腔诊具，体温计等（3）中度危险物品必须进行严格消毒，按现代消毒学观点，应该用热力消毒方法或高效化学消毒剂进行消毒。

3.低度危险物品即非关键性物品（1）是指那些不直接接触病人或只接触病人正常皮肤的物品。（2）主要包括诊疗设备，床具卧具，病房家具，室内环境表面，听诊器，诊锤，氧气面罩，湿化器管道等。（3）低度危险品以清洁为主，只有在已经污染或可疑污染的情况下才需要消毒处理。消毒可根据情况使用含氯清洗消毒剂，不宜在医院环境中大量使用低效消毒剂，以免使环境中产生耐消毒剂菌株。

（二）按器械构造分类 1.表面光滑的器械这类器械以光滑表面为主，体积大，如各种拉钩、大型骨科器械、刀柄刀片、仪器表面等，这类器械比较容易清洗消毒。

2.带有关节和钩纹的器械很多外科器械都带有关节、沟、钩、槽状结构，如剪刀、血管钳、持针器、骨钳和牙钳、开合器、镊子等。这类器械的关节处、沟纹处的污染物清洗消毒比较困难，必须仔细刷洗干净，消毒灭菌时必须将关节打开。

3.带有窄缝隙、细孔或盲管的器械临床有许多特殊器械，带有很窄的缝隙或细孔和管道，如注射器、各种注射针头和穿刺针、吸引器管、探察器、细纤维窥镜等。这些器械不仅清洗困难、容易藏污纳垢，而且消毒灭菌因子难以穿透，往往造成消毒灭菌失败，应给予特别关注。

（三）按材料性质分类不同性质的材料制作的医疗器械对消毒灭菌处理有特殊的选择性和要求。 1.金属类器械外科器械绝大部分由金属材料作成，钢铁材料居多，铜铝制品为少数，个别特种器械用到金银等。金属器械对灭菌因子的适应性比较广，它们耐高温、耐高压、耐辐射，但多数怕腐蚀，使用化学消毒剂时应予注意。

2.玻璃陶瓷制品在医疗器材家族中，有不少为玻璃陶瓷制品，注射器、输液器和输血器、检验器材等。玻璃陶瓷器材多数耐高温，耐辐射，耐氧化、耐酸碱，容易清洗和消毒；大多数对灭菌因子适应性比较广，容易灭菌；但它们易碎，很薄的玻璃器材不耐压力。

3.高分子材料制品现代医疗器材及仪器零部件多为化学高分子合成材料制成，如橡胶、硅胶、乳胶制品，塑料和尼龙制品等。高分子材料制品主要有各种导管、纤维管、输血输液胶管、吸引管、外科手套、呼吸麻醉软管、透析软管以及人工器官等。它们大多耐辐射、耐腐蚀、耐酸碱，但不耐高温，清洗比较困难，无理想的灭菌方法。要求在彻底清洗的条件下，选择低温灭菌方法进行灭菌处理。

4.其他类型医疗用品中尚有棉织品、纸制品（被污染文件书籍、包装材料等）、一些特殊用品（电极、电刀、电焊、电线等），它们的共同的特点是怕湿、不耐高温，不适宜用高温灭菌和化学消毒剂浸泡。它们的灭菌往往采用福尔马林或环氧乙烷熏蒸、微波消毒、低温等离子体灭菌技术等方法。

消毒与清洗方法

（一）清洗消毒用品

清洗剂或洗涤剂医疗用品清洗所使用的清洗剂种类主要有表面活性剂，复合生物酶清洗剂，去污型消毒剂。（1）表面活性剂类型（洗衣粉、软肥皂、液体洗涤剂等）表面活性剂去污作用的原理有润湿作用可促进干燥污染物的软化、乳化作用促进蛋白质和脂类物质溶解分散、分散作用促进颗粒性物质粉碎、泡沫作用可吸附污物颗粒、增溶作用促进有机物质溶解。

（2）复合生物酶清洗剂（包括粉剂和液体制剂）复合生物酶含有蛋白溶解酶、脂肪溶解酶以及淀粉水解酶等与表面活性剂组成；酶具有催化特性其催化效率比普通催化剂高1013倍；酶作用选择性强，每种酶只能水解特定的有机物质；酶活性受多种因素影响，如温度、ph值、重金属离子、酶抑制剂、酶激活剂等。

（3）去污消毒剂具有去污能力的消毒剂巧妙地把去污与杀菌能力结合起来，集杀菌与去污于一身，将消毒与清洗一步完成；消毒剂中的洗涤剂把干燥黏附在器械表面的污染溶解于水中更有利于杀菌，极大地提高了污染物品处理的方便性。具有去污能力的消毒剂国内市场主要有各种品牌的84消毒液，氯化磷酸钠为主要成分的消毒剂。

2.清洗技术（1）手工清洗技术各种结构复杂的器械，如管状物品、有孔物品、带缝隙或有齿有槽等物品需要进行手工刷洗技术；某基层单位不具备机器清洗条件，所有器械都需要手工清洗。配合手工清洗的用品主要有各种适合的刷洗工具和洗涤剂。手工清洗过程一般包括冷水清洗、洗涤剂清洗、漂洗、加强热水清洗消毒。

（2）机器清洗技术除必须进行手工清洗的器械之外所有物品都适合机器清洗。目前医疗机构采用的清洗机根据不同对象选择机器类型，如普通医疗器械选择超声清洗机和医疗器械自动清洗机，内镜有专用清洗消毒机、麻醉管道和呼吸机管道专用清洗消毒机等。

清洗效果检测

目前对于医疗器械清洗效果检测尚无规范统一的方法和检测指标。国内医疗机构在清洗效果检测中使用目测法、隐血试验法、细菌总数检测法、鲎试验法等。目测法只能观察到器械上明显污迹或锈斑等，过于粗造。隐血试验，灵敏性较低。细菌计数法检测，不能全部表达清洁程度，操作复杂，出结果慢。鲎试验法耗时长，成本高，适用范围窄。嘉峪检测网提醒您近年来，国外推出atp（三磷酸腺苷）生物发光(bioluminescence)技术，来检测清洗后器械上残留细菌和蛋白质。

（一）隐血试验在试纸上滴2滴联苯胺染液，然后擦拭清洗过的器械，于2min后观察结果。试纸呈紫色反应即为隐血试验阳性；使用后立即冲洗的器械，隐血试验阳性率应小于5％。

（二）细菌总数检测法将各种清洗后器械用适当采样液洗涤清洗后的器械，或用涂抹法采样器械特殊部位，制备成采样液。然后对不同采样液体标本进行活菌计数培养，检测采样单元细菌总数。

（三）atp生物发光法 1 、原理 atp生物荧光法测定原理是利用荧光素酶在镁离子、atp、氧参与下，催化荧光素氧化脱羧，产生激活态的氧化荧光素，并放出光子，产生560nm的荧光。在裂解液的作用下，细菌裂解后释放的atp参与上述酶促反应，用荧光检测仪可定量测定发光值，从而获知atp的含量，进而反映细菌含量。

2 、检测含菌液体标本中细菌总数取含菌悬液50μl加入到无菌离心管中，然后加入50μl裂解液，混匀后室温下放置10s,再加入400μl荧光素酶，迅速混匀后用荧光光度计测定其相对光单位值（rlu）。以相对光单位值作为活菌数参考值。

3 、检测清洗后械器上存活菌将定量采样液置于适当的采样容器内，把清洗后的器械置于其中进行充分洗脱。取50μl洗脱液加入到无菌离心管中，然后加入50μl裂解液，混匀后室温下放置10s后,加入400μl荧光素酶，迅速混匀，用荧光光度计测定其rlu。

（四）清洗洁净度客观标准 1、目测法判定标准清洗后器械晾干后，目测器械表面无任何肉眼可见污迹，光洁无瑕疵，判定为合格，记录﹙﹣﹚减号；清洗后的器械上肉眼可见斑点，但不明显，记录为﹙﹢﹚号；清洗后器械上可见数处斑点，记录为﹙ ﹚号；清洗后器械上可见明显污迹，依据多少记录为（＋＋＋～＋＋＋＋）号。 2、隐血试验判定标准。 3、清洗后器械上残留菌数允许标准（1）外科器械清洗后残留活菌数应＜500cfu/件；（2）内镜清洗后残留活菌数≤20cfu／件。 4、内毒素允许标准。

医疗器械清洗中存在的问题

（一）使用后器械处理不当对污染有血液、脓液、体液、分泌物等的医疗器械没有能立即用水冲洗，使得污染物干固在器械上，给清洗带来困难。使用中沾染有上述污染物的器械用后应立即用水冲洗干净，当时不能冲洗应在2h内处理。

（二）先消毒后清洗带来的影响带血器械用高于90℃热力消毒或用醛类消毒剂进行消毒，会造成蛋白凝固，使得污染物黏附的更牢固，给清洗带来困难。这些问题往往发生在手工清洗过程中，使用自动清洗机进行清洗，消毒与清洗在一个连续过程中，可以克服这些问题。

（三）清洗剂选择使用不当使用后的医疗用品上污染有无机物，应选用酸性洗涤剂清洗；污染有机物质，选择碱性洗涤剂；污染有机物且器械结构复杂，应选择生物酶洗涤剂。清洗剂使用中的问题主要是： ①酶洗剂配制后反复使用多次，这不仅会使清洗作用降低，还有可能造成二次污染；②洗涤剂用量不足或浓度过低，会导致清洗能力下降； ③酶洗时温度控制不当影响酶洗效果，酶洗剂在水温低于30℃条件下不能完全激活酶活性，水温高于50℃会使酶失去部分活性并随温度升高酶活性损失增加，直到完全消失。

（四）清洗方法不规范医疗器械清洗不仅要考虑污染情况，还要考虑器械的性能、结构、材质等因素。不能认为只要有自动清洗机就完全不用手工刷洗，也不能认为酶洗剂就是万能。嘉峪检测网提醒您，有少数清洗操作人员把有关节的器械处于闭合状态就投入机器清洗；还有带管腔的器械与其他器械混到一起投入清洗机内，医疗器械检测这些操作都不符合规范要求。

影响医疗器械清洗效果的因素

（一）器械结构复杂性有些器械带有齿、缝隙、细孔和关节或长管，比较难清洗。对于此类器械清洗时必须尽可能折卸，采用手工仔细刷洗。

（二）物品性质在医疗用品中，依据其材料性质对清洗因素耐受性不同。有耐清洗、耐腐蚀器械，有怕腐蚀器械；有耐酸碱器械，也有不耐酸碱的器械。应根据不同情况，选择清洗方法和洗涤剂。

（三）污物的性质外科器械上污染有血迹、脓迹、排泄物和分泌物，污染微生物数量大；污染特别严重的器械应占少部分。大量医疗用品都属于一般性污染，不需要特别处理。对于污染特别严重的物品，在选择清洗方法和洗涤剂方面要给予特别关注。

（四）物品上有机物变干使用后医疗物品上污染的有机物质没有及时用水冲洗，干固在物品表面甚至在管腔内，清洗时很难将有机物彻底去除。

（五）清洗的方法对于不同污染医疗用品，选择清洗方法不当，会影响清洗效果。应根据不同情况，选择手工清洗，机械清洗，超声清洗等；选择合适的工具和科学选择洗涤剂。

（六）生物膜的存在的影响绿脓肝菌、大肠肝菌和金黄色葡萄球菌等细菌可粘附于物体表面形成生物膜-以及不同种类细菌的混合群体，不仅可阻挡理化因子，也可影响清洗作用。生物膜可在水池、水管和一些医疗器材(透镜、导尿管、中心静脉导管)中形成而不易清除。用有效的消毒剂、洗涤剂或酶洗剂等加机械力进行清洗，可有效清除生物膜性物质。

大家知道无菌医疗器械最重要的一个特点之一是——

无菌

在几种工业化使用的灭菌方法中，环氧乙烷灭菌以其适用范围广泛、成本低、可操作性等优势被广泛使用于医疗器械的灭菌中。

环氧乙烷灭菌原理环氧乙烷气体是一种容易发生聚合和烷基化的小分子化学物质。极容易与生命大分子中的羧基发生氧化还原反应，从而破坏细菌的功能结构，达到抑制细菌的生长的目的。

环氧乙烷分子结构

环氧乙烷烷基化反应与环氧乙烷发生烷基化反应的生命大分子主要有蛋白质和核酸。蛋白质是细菌膜系统的重要生命功能的执行者，而核酸是细菌繁衍的遗传信息携带者。这两种分子发生烷基化后，作为生命功能分子的高级结构会遭到破坏，从而阻断细菌及其芽孢的各种活动。这就是环氧乙烷灭菌作用机理。

研发阶段产品灭菌的考虑近几年，我国医疗器械产业极速发展，尤其是中高端医疗器械工具领域，如各种新型微创器械、各种新型材料器械等。在这些领域中，很多公司都处于产品研发阶段。如果产品最终提供的形式是无菌器械，一个良好的产品策划，应该立项的开始就考虑灭菌方式以及灭菌方式对产品的性能、结构、材质等诸多方面的要求。那么具体要考虑那些主要方面呢？

首先是产品材质

要考虑的重点是材质跟环氧乙烷气体是否发生反应。一般来说，辅料类产品(如棉纱制品、无纺布制品)、塑料产品(如各种管路、导管、输注产品)以及金属产品(如吻合器、骨科产品、心血管产品等)均适合于环氧乙烷灭菌。但有些产品经过环氧乙烷处理后存在发生变色等负面影响。也有一些器械带液体，这些可能不适合于环氧乙烷灭菌。

另外

要考虑材质的特殊要求，各种涂层(如心脏支架药物涂层、骨科器械的生物活性涂层等)，对温湿度有特殊要求的产品(如有的产品对温度有要求，如硅胶垫高温变形)，在设计开发之初就应该考虑是否适合环氧乙烷灭菌并予以验证。对粉末状产品，要考虑灭菌过程中的加湿以及抽负压造成的影响等。这样，从研发策划一开始就全面考虑产品的最终灭菌形式，可以大大减少企业研发和注册过程中的周折。

其次是产品结构

有些医疗器械产品带有腔体结构(如球囊)，还有产品有非常长的管道(如各种导丝的保护盘管)。因为气体通路和扩散难易的问题，这些

特殊结构都会对灭菌过程形成挑战。值得注意的是，普通输注产品等有护帽、三通阀的情况下，有时候成品出厂的产品状态规定了产品内部通路的通断，由此影响产品的气体通过可行性。因此尽量在产品设计之初就考虑到产品的交付状态，应该是尽量使产品腔体保持开放。

再次是产品包装方式

并不是所有的包装方式都适合于环氧乙烷灭菌。

对于某些不能以eo气体“呼吸”方式进出初包装的产品包装，应当慎重考虑环氧乙烷气体灭菌的可行性。这方面的要求可以在en868和iso11607等相关的包装系列标准中查找。

还有一种特殊的状态需要特别加以注意：您的产品在出厂时是以非无菌状态提供，但是在产品说明书中推荐了灭菌的参数，由使用单位在使用前进行灭菌。这种情况下，

企业在提交注册材料时应该同时提交推荐的灭菌参数的确认报告。企业应该在产品研发之初，认真策划以上方面，保证您的产品在注册和生产过程中顺利进行。上海必趣医疗科技有限公司依据国际灭菌标准iso11135:2014建立了相关体系，并通过了著名的国际iso13485:2016/iso11135:2014灭菌服务认证，我们有一流的团队，在知识传递、管理方面有卓越的经验，在以上方面可为您供专业的建议、一流的环氧乙烷灭菌相关服务，欢迎大家前来洽询。

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利用acdsf3/acdsr4引物快速鉴定产acc脱氨酶细菌

acdsf3/acdsr4 primer pair for rapid identification of acc deaminase

producing bacteria

张宇薇2，彭龙2，袁志林1, 2 *，秦媛3，潘雪玉4

1林木遗传育种国家重点实验室，中国林业科学研究院，北京；2中国林业科学研究院亚热带林业研究所，杭州；3中国林业科学研究院热带林业研究所，广州，广东；4中国科学院遗传与发育生物学研究所，北京

*通讯作者邮箱：yuanzl@caf.ac.cn

摘要：通过产生acc脱氨酶降低胁迫乙烯水平并缓解盐胁迫危害，是植物根际促生菌（pgpr）促进宿主生长和抗逆的重要机制。acc脱氨酶可以降解乙烯的直接前体1-氨基环丙烷-1-羧酸（acc），从而降低乙烯浓度，促进植物生长抗逆。目前，传统的鉴定acc脱氨酶的方法：①根据acc是一种非蛋白氨基酸的特性，采用氨基酸层析的方法进行检测筛选；②以acc为唯一氮源进行分离筛选产acc脱氨酶细菌。本研究采用pcr技术，较传统的方法更加高效快速且灵敏度高。利用acdsf3/acdsr4引物能有效扩增出细菌中编码acc脱氨酶的acds基因片段，从而快速筛选出产acc脱氨酶菌株。本研究还比较了不同acc脱氨酶基因扩增引物的效率，结果表明，引物acdsf3/acdsr4特异性较好，且目的产物条带亮，扩增成功率高。

关键词：植物促生长根际细菌，内生细菌，产acc脱氨酶细菌

材料与试剂

1.无菌塑封袋 (170 mm×120 mm、140 mm×100 mm)

2.细菌基因组dna提取试剂盒 (离心柱形) (天根生化科技有限公司，qiagen, catalog number: dp302-02)

3.acc (1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid) (上海意杰生物科技有限公司，merck, catalog number: 149101)

4.16s rrna序列扩增引物 (由上海生物工程技术服务有限公司合成)

5.琼脂 (北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，ding gou, catalog number: dh010-1.1)

6.苯菌灵 (溶剂为二甲基亚砜) (上海麦克林生化科技有限公司，麦克林，catalog number: b828272)

7.抑霉唑硫酸盐 (上海振誉生物科技有限公司，阿拉丁，catalog number: i135647)

8.胰蛋白胨 (杭州微生物试剂有限公司，hanwei, catalog number: y0005)

9.nacl (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10019318)

10.酵母提取物 (yeast extract) (oxoid公司，oxoid, catalog number: lp0021)

11.蛋白胨 (杭州微生物试剂有限公司，hanwei, catalog number: y0004)

12.酪蛋白水解物 (casein acid hydrilysates) (solarbio公司，solarbio, catalog number: c8220)

13.kh2po4 (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10017618)

14.硼酸 (上海麦克林生化科技有限公司，麦克林，catalog number: b802844)

15.mnso4 (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 20026917)

16.znso4·7h2o (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10024018)

17.cuso4·5h2o (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10008218)

18.na2moo4·2h2o (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10019818)

19.葡萄糖 (上海麦克林生化科技有限公司，麦克林，catalog number: d810588)

20.柠檬酸 (生工生物工程 (上海) 股份有限公司，diamond, catalog number: a100529)

21.(nh4)2so4 (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10002918)

22.(nh4)2hpo4 (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10002718)

23.mgso4·7h2o (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10013018)

24.feso4·7h2o (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10012118)

25.细菌琼脂粉 (bacto-agar) (碧迪医疗器械 (上海) 有限公司，bd, catalog number: 214010)

26.葡萄糖酸 (上海阿拉丁生化科技股份有限公司, 阿拉丁, catalog number: g111173)

27.无水乙醇 (国药集团化学试剂有限公司, 沪试, catalog number: 10009218)

28.次氯酸钠溶液 (≥5.2%活性氯) (国药集团化学试剂有限公司, 沪试, catalog number: 80010428)

29.10× pbs粉末 (生工生物工程 (上海) 股份有限公司，bbi, catalog number: pd0100)

30.硫酸链霉素 (genview公司，genview, catalog number: as325)

31.盐酸四环素 (上海麦克林生化科技有限公司，麦克林，catalog number: d807503)

32.无菌去离子水

33.超纯水

34.各种型号的枪头

35.离心管 (50 ml)

36.dl2,000 dna marker (北京康为世纪生物科技有限公司，takara, catalog number: cw2583s)

37.2× taqmastermix (不含染料) (北京康为世纪生物科技有限公司，康为世纪，catalog number: cw0718)

38.1/10胰蛋白胨大豆培养基 (tryptic soy agar, tsa) (碧迪医疗器械 (上海) 有限公司，bd, catalog number: gd-236940) (见溶液配方)

39.假单胞杆菌分离培养基 (pseudomonas isolation agar, pia) (碧迪医疗器械 (上海) 有限公司，bd, catalog number: gd-292710) (见溶液配方)

40.luria-bertani (lb) 培养基 (见溶液配方)

41.paf液体培养基 (见溶液配方)

42.df培养基 (以硫酸铵或acc为唯一氮源) (见溶液配方)

43.adf培养基 (见溶液配方)

44.1× pbs缓冲液 (见溶液配方)

45.75%的乙醇溶液 (见溶液配方)

46.90%的乙醇溶液 (见溶液配方)

47.次氯酸钠溶液 (0.5%的活性氯) (见溶液配方)

仪器设备

1.超净工作台

2.剪刀

3.手术刀

4.镊子

5.研钵和研棒

6.酒精灯

7.纱布

8.4 °c冰箱

9.涡旋振荡器 (mobio公司，mobio, catalog number: vortex-genie 2)

10.台式高速冷冻离心机 (sigma公司，sigma, catalog number: 3k15)

11.涂布棒

12.接种环

13.牙签 (灭菌处理)

14.全温振荡器 (苏州培英实验设备有限公司，培英，catalog number: thz-c-1)

15.移液枪

16.-70 °c超低温冰箱

17.冷冻管 (2 ml)

18.超微量紫外分光光度计 (北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，quawell, catalog number: q5000)

19.mycycler pcr扩增仪 (bio-rad公司，bio-rad, catalog number: mycycler)

20.电泳仪 (北京六一仪器厂，北京六一，catalog number: dyy-6c)

21.立式压力蒸汽灭菌器 (上海申安医疗机器厂，shenan, catalog number: ldzf-50kb-ⅱ)

软件和数据库

1.bioedit v7.0.9软件 (https://file.org/free-download/bioedit)

2.genedoc v2.7.0软件 (http://nrbsc.org/gfx/genedoc/)

3.blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)

4.genbank数据库中的blast功能 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)

5.clustx1.81软件 (https://www.clustal.org/download/current/)

6.mega v5.1软件 (https://www.megasoftware.net/)

7.figtree v1.4.2软件 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)

实验步骤

一、根系及根际土样品采集

采集树木的根部及其根际土 (树木根系样品的收集范围在地下5-20 cm内，每个根系样品5-10 g)。将树木样品和土壤样品迅速装入塑封袋中。于冰盒中暂时存放，48 h 内运输至实验室进行细菌分离培养

二、树木根系表面消毒和研磨

1.用水将树木根系样品表面的杂物冲洗干净，再用镊子和剪刀将根系样品修剪成0.5-1 cm的小段。

2.在超净工作台中对样品进行表面消毒处理：先用75%的乙醇溶液 (按体积比用无菌水稀释) 浸泡样品1 min，弃去75%乙醇，接着用次氯酸钠溶液 (0.5%的活性氯) 浸泡样品5-10 min (具体时间视树木根系的幼嫩程度而定) ，再将样品放入装有90%的乙醇溶液的烧杯中漂洗次氯酸钠，最后用无菌水冲洗样品5次。

3.将已消毒的组织剪碎，置于无菌的50 ml离心管中，向管内倒入适量1×pbs缓冲液 (以刚没过样品为准)。将研磨枪枪头置于酒精灯外焰上灼烧后于无菌水中冷却。将上述50 ml离心管插入碎冰中冰浴，将灭菌处理过的研磨枪枪头伸入管内调至最低档研磨样品。

4.另取无菌的50 ml离心管，剪取一块无菌的纱布封在管口，将所得植物根系样品匀浆倒入无菌纱布封口的离心管内,得到根系研磨液，4°c冰箱内保存。

三、根际土的收集

1.取树木根系样品，抖落根外土，将带有根际土的树木根系样品修剪成0.5-1 cm的小段置于装有1× pbs缓冲液的50 ml离心管中，在离心管外标注好对应的样品编号。

2.将离心管放置在涡旋振荡器上充分振荡5 min，使根际土悬浮于缓冲液中。

3.取出根系样品，将根际土悬浮液10 °c下6,000 × g 离心15 min，倒掉上清液，收集根际土，放置于4 °c冰箱内保存。

四、内生细菌和根际细菌的分离纯化

1.取1 ml根系研磨液或1 g根际土，加1× pbs缓冲液至99 ml，重新悬浮并充分混匀，随后按照1∶10的比例依次进行系列稀释，分别得到10-3、10-4和10-5 3个浓度的样品悬浮液。选取其中10-4和10-5两个浓度梯度的样品悬液，充分混匀后各取100 μl，涂布于1/10 tsa、pia培养基表面。每种培养基不同样品各浓度重复3次，作好标记。

2.22 °c避光培养3-4 d，及时观察细菌菌落。挑取不同形态的单菌落用“连续划线法”和“三线法”在lb培养基上进行纯化，直至出现单菌落。

五、产acc脱氨酶细菌的分离和保存

1.取1 ml根系研磨液或根际土悬浮液，分别经paf培养基、以硫酸铵或acc为唯一氮源的df培养基和adf培养基进行筛选和培养，最后挑取不同形态的单菌落在lb培养基上划线纯化。

2.对分离纯化后所得细菌进行低温冷冻保藏，具体方法为：在超净台中以镊子夹取灭菌处理后的牙签从lb培养基上挑取细菌单菌落，放入50 ml液体lb培养液中，在28 °c旋转摇床200 r/min条件下培养12 h后，取无菌1.5ml离心管，收集?1 ml?菌液以5,000 × g 转速离心10 min，弃去上清液，添加灭菌处理过的?50%甘油，利用移液枪吹打混匀后，将所得悬浊液加入冷冻管中于超低温冰箱 (-70 °c) 中保藏。

六、细菌基因组的提取和pcr扩增

1.挑取细菌单菌落至25 ml lb培养基中，28 °c振荡培养 (180 r/min培养24 h)至对数期取适量菌液，以5,000 × g 转速离心收集菌体，使用细菌基因组提取试剂盒，依照其步骤提取基因组。

2.使用超微量紫外分光光度计测定dna浓度，并根据od260/280比值检测样品dna纯度 (od260/280=1.6-1.8)，-20 °c保存样品。

3.以细菌基因组dna为模板，对16s rrna基因片段进行pcr扩增。引物为细菌16s rrna通用引物356f和1064r (秦媛 et al., 2017)，扩增区域为v3-v5可变区，扩增体系共50 μl，其中模板3 μl (约50 ng) ，正向反向引物各0.5 μl (浓度50 μmol/l) ，25 μl 2×taq mastermix (不含染料) ，最后用无菌去离子水补足至50 μl。pcr扩增条件为90 °c预变性4 min；94 °c变性40 s，58 °c退火50 s，72 °c延伸1 min，30个循环；72 °c延伸10 min，4 °c保存。

4.pcr产物用1.0%的琼脂糖凝胶分离，再用dna纯化试剂盒对目的片段进行胶回收并送至测序公司进行测序。

七、利用pcr技术筛选产acc脱氨酶的细菌

提取富集筛选得到的细菌菌株的基因组dna作为pcr反应的模板，选择合适的引物来pcr扩增acds片段从而筛选具acc脱氨酶活性的细菌。本研究参考相关文献选用degaccf/degaccr (c et al., 2006)、f1936f/f1938r (h et al., 2011)和acdsf3/acdsr4 (li et al., 2015)三对引物，引物信息详情见表1，引物中的简并碱基符号对应表如表2。这三对引物在报道中被认为行之有效，如基于宏基因组方法检测环境样品acds基因的遗传多样性。在利用pcr技术扩增目标片段时，需要根据实际的实验情况来选择合适的引物。

表1 引物名称、序列及退火温度引物碱基序列(5'→3')片段大小/bp退火温度/°c参考文献degaccfggbggvaayaarmyvmgsaagctyga75055c, d, ms, & y (2006)degaccrttdcchkyrtanacbggrtcf1936fghgamgactgcaaywsyggc79251h, b, & a (2011)f1938ratcatvccvtgcatbgayttacdsf3atcggcggcatccagwsnaaycanac76058li et al. (2015)acdsr4ggcacgccgcccarrtgnrcrta

1.使用degaccf和degaccr这对引物进行pcr扩增，采用50 μl体系：上下游引物degaccf和degaccr各加0.5 μl，dna模板3 μl，2× taq-mastermix 25 μl及21 μl去离子水。pcr扩增程序设置为：90 °c预变性4 min；95 °c变性40 s，55 °c退火1 min，72 °c延伸1 min，35次循环；72 °c延伸5 min；4 °c保存。pcr扩增所得产物直接进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2.使用f1936f和f1938r这对引物进行pcr扩增，采用50 μl体系：上下游引物f1936f和f1938r各加0.5 μl，dna模板3 μl，2× taq-mastermix 25 μl及21 μl去离子水。pcr程序设置为：90 °c预变性4 min；95 °c变性40 s，51 °c退火1 min，72 °c延伸1 min，35次循环；72 °c延伸5 min；4 °c保存。pcr扩增所得产物直接进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

表2 简并碱基符号对应表简并碱基正常碱基ra/gyc/tma/ckg/tsg/cwa/tha/t/cbg/t/cvg/a/cdg/a/tna/t/c/g

3.使用acdsf3和acdsr4这对引物，采用50 μl pcr扩增体系：上下游引物acdsf3 和acdsr4各加0.5 μl，dna模板2 μl，2× taq-mastermix 25 μl及22 μl去离子水。采取递减pcr (touchdown-pcr) 的方法：94 °c预变10 min；94 °c变性40 s，65 °c退火50 s，72 °c延伸1 min，每个循环退火温度降低 0.4 °c，15个循环后退火降至58 °c，循环20次；72 °c延伸10 min，4 °c保存。pcr扩增所得产物直接进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

5.将电泳后所得与目的片段大小一致的条带切胶，送往测序公司进行ta克隆测序。测序结果经使用bioedit v7.0.9和genedoc v2.7.0等序列比对软件进行人工修饰，并使用editseq (dna star 7.1)软件将核苷酸序列翻译为氨基酸，并与已公布的相近物种同一片段的氨基酸序列对比，去除核苷酸序列内含子，得到相应氨基酸序列。最终通过ncbi网站进行blast比对，确定是否为acds基因编码的acc脱氨酶。

八、核苷酸序列比对和系统发育分析

1.16s rrna和acds基因测序结果用bioedit v7.0.9和genedoc v2.7.0等序列比对软件进行编辑，去除两端不准确序列后(一般去除80 bp)，在genbank数据库中用blast功能进行相似性搜索。

2.调取匹配度较高的已登记菌株相应序列，通过clustx1.81软件进行多序列比对，利用mega v5.1软件通过neighbor-joining法分别构建基于16s rrna和acds基因的系统发育进化树。其中，构建16s rrna系统发育树时选择asticcacaulis solisilvae、a. benevestitus、a. exxentricus和brevundimonas sp.作为外群，构建acds基因系统发育树时选择rhizobium leguminosarum、r. gallicum、sinorhizaobium meliloti和pseudomonas sp.作为外群。

3.生成outree文件后，使用figtree v1.4.2软件对系统发育树进行编辑和注释。

九、acds基因编码的氨基酸序列的比对与系统发育分析

1.将扩增得到的acds 基因原始序列，与genbank数据库中已描述菌株对比，去除核苷酸序列内含子，得到分离样品中acc 脱氨酶菌株编码acc脱氨酶氨基酸的基因序列。

2.去除内含子的基因序列进行blastx和protein blast搜索，调取匹配度高的已知菌株acds基因序列及氨基酸序列，通过clustx1.81软件进行多序列比对，利用mega v5.1 软件选用poisson correction模型构建基于细菌acds基因核苷酸和氨基酸序列的系统发育进化树。

结果与分析

实验采集样品以10种盐生植物和杨树为例，进行结果分析：采样地点为山东省青岛市黄岛区滨海大道风河大桥风河人海口和浙江省杭州市富阳区新登镇杨树良种基地，共采集10种盐生植物：盐地碱蓬 (suaeda salsa) 、砂引草 (messerschmidia sibirica) 、肾叶打碗花 (calystegia soldanella) 、西伯利亚蓼 (polygonum sibiricum) 、糙叶苔草 (carex scabrifolia) 、筛草 (carex kobomugi) 、滨藜 (atriplex patens) 、无翅猪毛菜 (salsola komarovii) 、芦苇 (phragmites australis) 以及地肤 (kochia scoparia) 和美洲黑杨 (populus deltoids) 的根部及其根际土。

1.盐生植物和杨树根际根内生细菌分离情况

经分离纯化、富集培养和16s rrna分子鉴定 (图1. a) ，从10种盐生植物和杨树样品中所得根际细菌154株，根内生细菌93株，共计247株。基于其16s rrna片段在ncbi数据库进行blast比对，对其分类地位进行初步鉴定，结果显示其中243个菌株属于变形菌门 (proteobacteria) ，分属于γ变形菌纲 (gammaproteobacteria) 、β变形菌纲 (betaproteobacteria) 、α变形菌纲 (alphaproteobacteria) ；剩余4个菌株属于厚壁菌门 (firmicutes) 芽胞杆菌纲 (bacilli) 。各个分类单元中，内生细菌和根际细菌所占比例相当，无明显差异。内生细菌和根际细菌宿主和类别分布无明显规律，说明其宿主特异性较低。

2.引物筛选结果

pcr扩增产物电泳结果显示，使用引物对degaccf/degaccr扩增出现较多非特异性条带且各片段大小不一，提高退火温度后，非特异性条带较多，且具有假阳性现象。使用引物对f1936f/f1938r的pcr扩增产物电泳结果中特异性条带较多，其中大小在790 bp左右的条带较多，但克隆测序结果表明扩增出的片段不是目的基因acds。acdsf3和acdsr4引物的pcr扩增产物电泳结果表明，条带清晰且特异性较好，片段大小在750 bp左右，与目的片段相符，扩增成功率高 (图1. b) 。因此，本实验最终确定采用的是acdsf3/acdsr4引物对及其pcr反应体系。

3.筛选得到25个产acc脱氨酶的菌株

采用acdsf3/acdsr4引物对及其pcr反应体系，对编码acc脱氨酶的acds序列基因片段进行扩增和克隆测序，结果显示其中25株细菌的基因组中可扩增出acds基因。该25株菌株相关信息及16s rrna、acds基因的genbank登录号，见表3。

4.具acc脱氨酶活性细菌16s rrna序列的分析

基于16s rrna构建的系统发育树中可以看出 (图2)，具acc脱氨酶活性的24株根际细菌和1株内生细菌分布于β变形菌纲 (betaproteobacteria) 的伯克氏菌属 (burkholderia spp.) 、贪铜菌属 (curiavidus spp.) 、多嗜菌属 (variovorax spp.) 和无色杆菌属 (achromobacter spp.) ，以及γ变形菌纲 (gamaproteobacteria) 的假单胞杆菌属 (pseudomonas spp.) 和盐单胞菌属 (halomonas spp.) 内，共计2个纲6个属。在归类于β变形菌纲的15株细菌中，宿主植物为盐生植物根际或根系的8个细菌全部分布于无色杆菌属，且亲缘关系较近；而伯克氏菌属、贪铜菌属和多嗜菌属内则均为杨树根际细菌。γ变形菌纲10个细菌中，9个分离自盐生植物或杨树根际的细菌属于假单胞菌属，且属内多样性较丰富。系统发育树中步移值大于等于50的在分支节点标出，分支长度与同源进化呈正比关系。

5.具acc脱氨酶活性细菌acds序列的分析

使用acdsf3和acdsr4这对引物对acds基因扩增，获得相应基因片段，去掉内含子并翻译为相应氨基酸序列后在ncbi数据库内与已报道菌株进行blast比对，结果显示同源性为93%-99% (表4)。通过基于acds基因核苷酸序列构建的系统发育树(图3)和基于acds基因编码的氨基酸序列构建的系统发育树(图4)可以看出，25株具acc脱氨酶活性的细菌主要归类于两大基因簇。系统发育树中上部分基因簇中16个菌株分属4个亚群，其中lw-rs-pia-1，lw-rs-pia-3、syc-rs-tsa-3和 syc-rs-pia-6等4个假单胞菌属(pseudomonas sp.)细菌同源性较高，功能最为相近，df-rs-pia-3及xdpop-rs-tsa-17两个假单胞菌(pseudomonas sp.)与lw-rs-pia-1等4个假单胞菌的同源性较为接近；而xdpop-rs-tsa-8 (pseudo-monas sp.)、xb-rs-pia-11 (halomonas sp.)则各形成一个相对独立的分支。xdpop-rs-pia-16和xdpop-rs-pia-1 (burkholderia sp.)属于一个亚群，从图3中可看出该亚群与其它3个亚群的同源性较近，但是从图4中可看出该亚群形成较独立分支，功能较为特殊。中下部分基因簇中包含9个菌株，由图3所示，dw-rs-pia-1、df-rs-pia-1、df-rs-acc-6、lw-rs-acc-3、syc-rs-tsa-4等5个无色杆菌 (achromobacter sp.)及xdpop-rs-tsa-16 (pseudomonas sp.)同源性较高，为一个亚群，由图4所示，xdpop-rs-tsa-16 (pseudomonas sp.)在功能上形成一个独立的分支；另外，由图3、图4中可看出，syc-rs-pia-8和syc-rs-pia-9两个无色杆菌(achromobacter sp.)与jp-r-acc-12 (pseudomonas sp.)为另外一个亚群，功能相近同源性较高。xdpop-rs-pia-16 (burkholderi-a sp.) 、xb-rs-pia-11 (halomonas sp.) 同源性最低，氨基酸结构的新颖性暗示了在酶活和功能方面的特殊性。

图1 基于16s rrna和acds基因对16个代表性菌株pcr扩增产物电泳图谱

a：基于16s rrna的电泳检测结果，目的条带片段大小约650 bp；

b：基于acds基因的电泳检测结果，目的条带片段大小约750 bp；

m：dl2,000 dna marker扩增条带；

1-16为代表性16个菌株的电泳条带

表3. 具acc脱氨酶活性菌株相关信息及16s rrna和acds基因登录号 ? ? ? ? ? ? ? ? ?菌株编号分类地位宿主植物分离部位采样地点genbank登录号16s rrnaacdslw-rs-acc-3achromobacter sp.p.australis根际土山东青岛ky305893ky305917syc-rs-tsa-3pseudomonas sp.m.sibirica根际土山东青岛ky305905ky305919syc-rs-tsa-4achromobacter sp.m.sibirica根际土山东青岛ky305904ky305920jp-r-acc-12achromobacter sp.s.salsa根内生山东青岛ky305892ky305921df-rs-acc-6achromobacter sp.k.scoparia根际土山东青岛ky305894ky305922lw-rs-pia-1pseudomonas sp.p.australis根际土山东青岛ky305895ky305923lw-rs-pia-3pseudomonas sp.p.australis根际土山东青岛ky305896ky305924df-rs-pia-1achromobacter sp.k. scoparia根际土山东青岛ky305897ky305925syc-rs-pia-8achromobacter sp.m. sibirica根际土山东青岛ky305898ky305926syc-rs-pia-9achromobacter sp.m. sibirica根际土山东青岛ky305899ky305927dw-rs-pia-1achromobacter sp.c. soldanella根际土山东青岛ky305900ky305928df-rs-pia-3pseudomonas sp.k. scoparia根际土山东青岛ky305902ky305929xb-rs-pia-11halomonas sp.p. sibiricum根际土山东青岛ky305903ky305930syc-rs-pia-6pseudomonas sp.m. sibirica根际土山东青岛ky305901ky305931xdpop-rs-tsa-8pseudomonas sp.p. deltoides根际土浙江新登ky305907ky305932xdpop-rs-tsa-2cupriavidus sp.p. deltoides根际土浙江新登ky305908ky305933xdpop-rs-tsa-4cupriavidus sp.p. deltoides根际土浙江新登ky305909ky305934xdpop-rs-pia-10variovorax sp.p. deltoides根际土浙江新登ky305911ky305935xdpop-rs-pia-41pseudomonas sp.p. deltoides根际土浙江新登ky305910ky305936xdpop-rs-tsa-16pseudomonas sp.p. deltoides根际土浙江新登ky305912ky305937xdpop-rs-tsa-17pseudomonas sp.p. deltoides根际土浙江新登ky305913ky305938xdpop-rs-pia-35burkholderia sp.p. deltoides根际土浙江新登ky305914ky305939xdpop-rs-pia-12burkholderia sp.p. deltoides根际土浙江新登ky305915ky305940xdpop-rs-pia-16burkholderia sp.p. deltoides根际土浙江新登ky305916ky305941xdpop-rs-pia-1burkholderia sp.p.. deltoides根际土浙江新登ky305906ky305918

图2 基于16s rrna构建的系统发育树

注：图中加粗字体部分表示实验中25种产acc脱氨酶的细菌菌株。

表4 具acc脱氨酶活性细菌氨基酸序列blast比对及相似性分析菌株编号分类地位鉴定最佳匹配菌株分类地位及登录号相似性xdpop-rs-pia-16burkholderia sp.paraburkholderia ferrariae (wp_028227857)93%xb-rs-pia-11halomonas sp.salinicola socius (wp_075571083)96%xdpop-rs-tsa-17pseudomonas sp.pseudomonas sp. (wp_008045265)96%xdpop-rs-tsa-2cupriavidus sp.cupriavidus necator (wp_013952982)97%xdpop-rs-pia-1burkholderia sp.burkholderia sp. (wp_034181893)98%lw-rs-pia-1pseudomonas sp.pseudomonas sp. (wp_024077475)98�-rs-pia-1achromobacter sp.achromobacter sp. (wp_050449820)98�-rs-pia-3pseudomonas sp.pseudomonas sp. (aca97076)98%xdpop-rs-tsa-4cupriavidus sp.cupriavidus necator (wp_018310822)98%xdpop-rs-pia-12cupriavidus sp.cupriavidus sp. (wp_035870474)98%xdpop-rs-tsa-16pseudomonas sp.achromobacter sp. (wp_054450759)99%xdpop-rs-pia-10variovorax sp.variovorax sp. (wp_070063219)99%xdpop-rs-pia-35cupriavidus sp.cupriavidus sp. (wp_035870474)99%lw-rs-acc-3achromobacter sp.achromobacter sp. (wp_050449820)99%syc-rs-tsa-3pseudomonas sp.pseudomonas sp. (wp_024077475)99%syc-rs-tsa-4achromobacter sp.achromobacter sp. (wp_050449820)99%jp-r-acc-12achromobacter sp.achromobacter sp. (se190266)99�-rs-acc-6achromobacter sp.achromobacter sp. (wp_050449820)99%lw-rs-pia-3pseudomonas sp.pseudomonas sp. (wp_024077475)99%syc-rs-pia-8achromobacter sp.achromobacter sp. (omp44721)99%syc-rs-pia-9achromobacter sp.achromobacter sp. (wp_062838559)99%dw-rs-pia-1achromobacter sp.achromobacter sp. (wp_046802671)99%syc-rs-pia-6pseudomonas sp.pseudomonas sp. (wp_024077475)99%xdpop-rs-tsa-8pseudomonas sp.pseudomonas sp. (wp_043304788)99%xdpop-rs-pia-41pseudomonas sp.variovorax sp. (sef22501)99%

图3 基于acds基因构建的系统发育树

图4 基于acds基因序列编码的氨基酸序列构建系统发育进化树

注：图3和图4系统发育树中的aurobasidum sp.属真菌，不同于细菌。通过检查aurobasidum sp.的核苷酸序列和蛋白序列，证实是编码acc脱氨酶基因的。这个真菌物种之所以能够含有内生细菌的acds基因，可能是存在着一种叫基因水平转移现象，就是说这个真菌物种通过基因水平转移的方式从产acc脱氨酶细菌获得了acds基因。

溶液配方

1.1/10胰蛋白胨大豆培养基 (tryptic soy agar, tsa) 配方 (秦媛, 2017)

tsa培养基4 g琼脂13.5 g

加超纯水至1 l, 121 °c灭菌25 min，待培养基冷却后，添加终浓度为50 μg/ml抑霉唑硫酸盐，抑制真菌生长

2.假单胞杆菌分离培养基 (pseudomonas isolation agar, pia) 配方 (秦媛, 2017)

pia培养基45 g甘油20 ml

加超纯水至1 l, 121 °c灭菌25 min，待培养基冷却后，添加终浓度为40 μg/ml苯菌灵，抑制真菌生长

3.luria-bertani (lb) 培养基配方 (秦媛, 2017)

胰蛋白胨10 gnacl10 g酵母提取物5 g琼脂16 g

加超纯水至1 l, 121 °c灭菌25 min，待培养基冷却后，添加终浓度为50 μg/ml抑霉唑硫酸盐，抑制真菌生长

4.paf液体培养基配方 (秦媛, 2017)

蛋白胨10 g酪蛋白水解物10 gmgso4 1.5 gkh2po41.5 g甘油10 ml

依次溶解于适量超纯水中，定容至1 l, 121 °c灭菌25 min

5.df液体培养基 (以硫酸铵为唯一氮源) 配方 (秦媛, 2017)

大量元素溶液1 l微量元素母液0.1 mlfeso4·7h2o溶液0.1ml

调ph=7.2, 121 °c灭菌25 min

大量元素、微量元素和feso4·7h2o溶液配制方法如下：

5.1配制微量元素母液

硼酸0.01 gmnso40.01 gznso4·7h2o0.125 gcuso4·5h2o0.078 gnamoo4·2h2o0.017 g

超纯水定容至100 ml，121 °c灭菌25 min。

5.2配制大量元素溶液

葡萄糖2 g葡萄糖酸2 g柠檬酸2 g(nh4)2so42 gkh2po44 g(nh4)2hpo44 gmgso4·7h2o0.2 g

加约500 ml超纯水充分溶解后定容至1 l，121 °c灭菌25 min。

5.3配置feso4·7h2o溶液

feso4·7h2o1 g

超纯水定容至100 ml，121 °c灭菌25 min。

6.adf培养基配方 (秦媛, 2017)

6.1adf液体培养基

1)用无菌水配置浓度10 mg/ml的acc母液，并用0.22 μm滤膜进行过滤灭菌备用。

2)配置不加硫酸铵的df液体培养基，121 °c灭菌25 min。

3)待培养基冷却后，加入适量acc母液，终浓度为3 mm。

6.2adf固体培养基

1)不加硫酸铵的df液体培养基，每升加18 g含氮量极低的细菌琼脂粉，121 °c高压灭菌25 min

2)待培养基冷却后倒平板，平板凝固后用acc母液涂板，每板300 μl，终浓度为3 μmol/plate

3)涂板后在超净台内风干1-2 h

7.1× pbs缓冲液配方 (秦媛, 2017)

10× pbs粉末38.28 g

加超纯水至4 l，调ph=7.2, 121 °c灭菌25 min。待培养基常温冷却至45 °c左右，加入终浓度分别为0.05 g/l和0.02 g/l的硫酸链霉素和盐酸四环素，抑制细菌污染。

8.75%的乙醇溶液 (见溶液配方)

先取75 ml无水乙醇加入洁净干燥的100 ml容量瓶中，再往容量瓶中加水定容到100 ml，即75%的乙醇溶液。

9.90%的乙醇溶液 (见溶液配方)

先取90 ml无水乙醇加入洁净干燥的100 ml容量瓶中，再往容量瓶中加水定容到100 ml，即90%的乙醇溶液。

10.次氯酸钠溶液 (0.5%的活性氯) (见溶液配方)

先取9615 μl次录酸钠溶液 (≥5.2%活性氯)加入洁净干燥的100 ml容量瓶中，再往容量瓶中加水定容到100 ml，即次氯酸钠溶液 (0.5%的活性氯)。

致谢

感谢国家自然科学基金/面上项目 (31370704) 、2014年度国家林业局引智项目以及2016年度留学回国人员科技活动项目择优资助经费对本研究的大力支持。

参考文献

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3.h, s., b, n., & a, s. (2011). metagenomic analysis of the 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase gene (acds) operon of an uncultured bacterial endophyte colonizing solanum tuberosum l. archives of microbiology, 193(9), 665-676.

4.li, z., chang, s., ye, s., chen, m., lin, l., li, y.,... an, q. (2015). differentiation of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (acc) deaminase from its homologs is the key for identifying bacteria containing acc deaminase. fems microbiology ecology, 91(10).

5.秦媛. (2017). 盐碱地植物共生微生物资源及功能初步研究. 硕士学位论文, 中国林业科学研究院.